中华按蚊溴氰菊酯抗性种群的接触性应激行为变化及其分子机制初探

摘要

中华按蚊是中国及东南亚国家最主要的疟疾等疾病的传播媒介之一，防控中华按蚊，切断其传播途径，是控制疟疾的关键。利用杀虫剂控制传播媒介是抗击疟疾的主要方法，拟除虫菊酯类杀虫剂是世界卫生组织唯一批准可用于浸渍蚊帐的杀虫剂，其中溴氰菊酯是中国应用最多的一种杀虫剂。在杀虫剂的长期作用下，蚊虫不仅形成严重的抗药性，其行为还发生改变，严重削弱现有防治手段的效果。中华按蚊对溴氰菊酯的抗性已有大量报道，但其行为变化还无相关研究。本研究以实验室敏感种群（WX-LS）和云南元阳（YY-FR）、重庆璧山（BS-FR）、安徽五河（WH-FR）野外抗性种群为研究对象，采用WHO区分剂量标准和方法测定中华按蚊对溴氰菊酯的抗性水平，利用分子手段进行物种鉴定和检测kdr基因突变情况；利用WHO锥形器分别测定这四个种群对溴氰菊酯蚊帐的接触性应激行为；对云南元阳野外和实验室敏感种群进行转录组测序，初步探讨及推测其行为改变的分子机制。主要研究结果如下： ①中华按蚊的抗性水平及kdr突变检测 通过接触筒法对中华按蚊溴氰菊酯抗药性进行生测，发现元阳、璧山和五河的野外种群对溴氰菊酯均产生了抗性，其中五河种群的抗性水平最高，其次是元阳和璧山种群。Kdr突变检测结果显示，璧山和五河种群均有3种kdr突变类型，分别为L1014F(TTT和TTC)和L1014C(TGT)，元阳种群没有kdr突变。璧山种群的kdr突变频率为82.88%，五河种群的突变频率为100%。 ②不同地理种群对溴氰菊酯的接触性应激行为测定 采用锥形器测定方法比较了实验室敏感蚊虫和野外抗性蚊虫对溴氰菊酯处理蚊帐（Deltamethrin treated net，DTN）的接触性应激行为，研究结果发现，敏感种群对溴氰菊酯有明显的接触性应激反应，而野外抗性种群对溴氰菊酯的应激反应与实验室敏感种群相比明显减弱。元阳抗性种群无kdr突变，其接触性应激行为也明显减弱，说明行为改变与kdr突变无关。 ③元阳行为弱化种群与实验室敏感种群的转录组测序与表达谱分析 采用锥形器测定方法筛选应激行为弱化的元阳种群，通过转录组测序比较元阳种群和实验室敏感种群的差异表达基因。分析结果发现有4101个基因显著差异表达，其中，在元阳种群中上调表达的基因有1843个，下调表达的基因有2258个。GO注释的差异基因有2494个，主要显著富集在生物过程和分子功能两部分，包括氧化还原过程、单个有机体代谢过程、有机循环化合物结合和催化活性等类别。差异上调表达基因的KEGG分析结果显示共有10条通路是显著富集的，分别为真核生物核糖体合成、DNA复制、错配修复、RNA聚合酶、核苷酸切除修复、碱基切除修复、RNA转运等；差异下调表达基因的KEGG分析发现碳代谢、淀粉和蔗糖代谢和丙酮酸代谢等通路是显著富集的。推测野外蚊虫接触性应激行为的减弱可能与能量供应水平减弱有关。

目录

1绪论

1.1研究背景

1.1.1蚊媒病的概述与控制

1.1.2杀虫剂的发展及其使用

1.1.3蚊虫对杀虫剂的抗药性

1.1.4中华按蚊抗药性的发展

1.2研究目的与意义

1.3技术路线

1.4本研究的创新性

2中华按蚊的抗性水平及kdr突变检测

2.1实验材料

2.1.1蚊虫采集地

2.1.2蚊虫的采集与饲养

2.1.3实验试剂及设备

2.2实验方法

2.2.1抗性水平生测

2.2.2蚊虫DNA提取

2.2.3蚊虫种类的分子鉴定

2.2.4 kdr片段扩增

2.2.5数据分析处理

2.3结果与讨论

2.3.1中华按蚊抗性生测结果

2.3.2分子鉴定和kdr基因的扩增

2.3.3 kdr基因突变检测结果及其分析

2.3.4讨论

3不同地理种群对溴氰菊酯的接触性应激行为比较

3.1实验材料

3.1.1供试昆虫

3.1.2实验仪器与设备

3.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1实验室敏感蚊虫对溴氰菊酯的接触性应激行为

3.3.2野外抗性种群对溴氰菊酯的接触性应激反应

3.3.3讨论

4回避行为弱化种群与敏感种群的转录组测序与表达谱分析

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1总RNA的提取和质量检测

4.2.2转录组测序

4.2.3生物信息分析流程

4.2.4基因差异表达分析的定量PCR验证

4.3结果与分析

4.3.1中华按蚊总RNA的质量检测

4.3.2碱基组成

4.3.3测序数据的质量情况

4.3.4数据过滤及信息比对

4.3.5 Reads在参考基因组不同区域的分布情况

4.3.6 RNA-Seq相关性分析

4.3.7基因表达水平分析

4.3.8差异表达分析

4.3.9差异基因GO富集分析

4.3.10差异基因KEGG富集分析

4.3.11基因表达差异分析结果验证

4.3.12讨论

5结论

参考文献

附录A：作者攻读硕士学位期间发表论文及科研情况

附录B：缩略词

致谢

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