TRIM25调控SIRT7蛋白稳定性机制及其功能研究

摘要

人类Sirtuins蛋白家族是一类依赖于NAD+的组蛋白去乙酰化酶，与酵母的Sir2基因同源，它们含有共同的保守催化结构域：去乙酰化结构域。在人类基因组中存在7种Sirtuins蛋白（SIRT1-7），参与了多种细胞生命活动，如热量限制，细胞衰老，代谢，染色体稳定，转录沉默等。SIRT7蛋白目前研究相对较少，在多种癌症中表达上调，很可能参与了癌症的发生发展过程。
　　人类Sirt7基因位于染色体17q25.3上，基因组含有10个外显子，mRNA全长1203bp，由400个氨基酸残基编码而成，蛋白分子量约为44.9KDa。Sirt7主要分布于细胞核当中，HDAC酶活性较低，既可以使组蛋白去乙酰化，也可以催化非组蛋白发生去乙酰化。SIRT7蛋白调节Pol I聚合酶亚基PAF53的去乙酰化，增强Pol I结合rDNA启动子的能力，上调rDNA的转录发生，促进细胞增殖和抑制凋亡的发生。SIRT7靶向结合特定基因启动子，介导H3K18Ac去乙酰化，稳定染色质构象，抑制特定抑癌基因的转录，维持癌细胞的侵袭形态。
　　泛素-蛋白酶体途径是负责调节体内蛋白水平和功能的重要机制。在这个过程中，泛素连接酶E3负责底物的选择性识别和特异性降解，是蛋白酶体降解途径的决定性因子。TRIM蛋白家族成员均含有RING结构域，普遍具有E3连接酶活性。在这里我们为寻找SIRT7的特异性E3展开了一系列实验，并通过CRISPR/Cas9技术构建了一株MCF-7敲除细胞系，以便后续深入研究SIRT7在乳腺癌的功能。主要的实验内容和结论如下所述：
　　①MCF7细胞敲除Sirt7后，影响p53的mRNA和蛋白水平：
　　MCF7敲除Sirt7基因后，发现其克隆形成能力并没有发生变化，而细胞周期受到影响。RT-qPCR和WB结果显示，Sirt7基因敲除后，p53的蛋白表达水平和mRNA表达水平均有上调。
　　②在293FT细胞内，TRIM25蛋白与SIRT7蛋白发生相互作用：
　　通过蛋白组学的实验数据，我们筛查出SIRT7的相互作用蛋白，其中泛素连接酶E3 TRIM25也在其中，是我们特别感兴趣的基因。为证实结果的可靠性，我们应用免疫共沉淀和免疫印迹的实验方法加以验证，并确认TRIM25和SIRT7蛋白两者之间确实存在相互作用的关系。
　　③TRIM25下调SIRT7蛋白稳定性并使其发生泛素化降解：
　　TRIM25质粒或空载体转染MCF7细胞和293FT细胞后，CHX药物处理细胞，分别检测内源性和外源性SIRT7蛋白表达水平，免疫印迹结果显示：TRIM25蛋白能使SIRT7蛋白的半衰期显著降低。体内泛素化实验结果进一步表明，TRIM25能使SIRT7蛋白发生特异性泛素化作用。

目录

缩略词表

1 绪 论

1.1课题研究背景

1.2 SIRT7研究进展

1.3本课题研究目的及主要内容

1.4本课题创新之处和局限性

2 SIRT7敲除型MCF-7细胞系构建及功能研究

2.1引言

2.2 材料和方法

2.3 实验方法

2.4 结果

2.5讨论

2.6小结

3 TRIM25调控SIRT7蛋白稳定性分子机制研究

3.1 引言

3.2材料与试剂

3.3 方法

3.4 结果

3.5 讨论

3.6小结

致谢

参考文献

附录

作者在读期间研究成果