Pyrithione及其铜络合物通过抑制蛋白酶体活性诱导肿瘤细胞死亡的体外研究

摘要

背景：
　　泛素-蛋白酶体系统是除了溶酶体系统外的另一个重要蛋白质降解的系统。它是一种耗能的、高效的、特异的蛋白质降解系统，控制着动植物细胞内绝大多数蛋白质的降解。泛素-蛋白酶体通路调控着动植物体内几乎所有的生命活动，该通路的失常可导致许多人类重大疾病，包括癌症和神经退行性病变。因而，该领域的研究引起了越来越广泛的兴趣，蛋白酶体本身已成为包括抗肿瘤在内多种疾病的重要靶点。尤其随着蛋白酶体抑制剂Velcade被用于治疗多发性骨髓瘤而上市，越来越多的研究学者将抗肿瘤药物的方向投向了研制出高效低毒的蛋白酶体抑制剂。本实验室已建立起对蛋白酶体抑制剂的筛选平台，并已筛选出多种蛋白酶体抑制剂，其筛选的范围也逐渐扩大，由临床用药到中药以及各个领域，因此寻找新的蛋白酶体抑制剂具有重要的意义。本研究发现pyrithione与CuCl2联合作用及其与铜形成的络合物（pyrithione铜盐）
　　能明显抑制蛋白酶体的活性，并能诱导多种肿瘤细胞的死亡。
　　目的：
　　本研究在实验前期工作的基础上，拟进一步探讨 pyrithione与CuCl2联合作用及其与铜形成的络合物pyrithione铜盐诱导肿瘤细胞死亡的机制及其与蛋白酶体抑制之间的关系。
　　方法
　　1.细胞活力测定：采用MTS方法检测pyrithione与CuCl2联合、pyrithione铜盐对肿瘤细胞活力的影响。
　　2.细胞死亡检测：荧光显微镜检测pyrithione与CuCl2联合、及pyrithione铜盐对细胞死亡的PI染色变化，Annexin V-FITC流式细胞术检测细胞死亡率。
　　3.蛋白检测：采用Western blot方法检测pyrithione与CuCl2联合、pyrithione铜盐对UPS系统内源性蛋白 Ub、外源性蛋白 GFPu、细胞死亡相关蛋白 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及PARP的变化。
　　4.蛋白酶体活性的测定：化学（荧光）发光法检测 pyrithione与 CuCl2联合、pyrithione铜盐对细胞内和体外抽提的蛋白中的蛋白酶体活性的变化。
　　结果：
　　1.Pyrithione与CuCl2联合对肿瘤细胞的毒性及蛋白酶体抑制效应
　　1.1Pyrithione与CuCl2联合对肿瘤细胞的毒性效应
　　1.1.1不同浓度(0.1μM-1.0μM)的pyrithione与CuCl2联合作用于人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞SMMC-7721、人骨髓瘤细胞U266、人骨髓瘤细胞NCI-H929后，细胞活力明显下降，其IC50值约为0.25μM。
　　1.1.2 Pyrithione0.5μM、0.75μM、1.0μM与CuCl2联合作用于U266细胞，PI染色阳性细胞明显增多，Annexin V-FITC流式细胞术结果示死亡率分别为39％、52%、75%。
　　1.1.3 Pyrithione0.5μM、0.75μM、1.0μM与CuCl2联合作用于MCF-7细胞，Annexin V-FITC染色阳性细胞数明显增多，并且PARP出现切割带，及Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9前体表达下调。
　　1.2 Pyrithione与CuCl2联合对蛋白酶体的抑制作用
　　1.2.1不同浓度（0.0625μM-1.0μM）的pyrithione与 CuCl2联合作用于人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞SMMC-7721、人骨髓瘤细胞U266、人骨髓瘤细胞NCI-H929后，对细胞内蛋白酶体活性有明显的抑制作用；两药联合后对体外抽提蛋白的蛋白酶体活性未见有抑制作用。
　　1.2.2 Pyrithione(0.5μM-1.0μM)与CuCl2联合作用MCF-7细胞、U266细胞、稳定转染GFPu的HEK-293细胞后，反应UPS系统的内源性蛋白Ub以及外源性蛋白GFPu呈浓度依赖及时间依赖性聚集增多。
　　2. Pyrithione与过氧化氢联合对U266细胞的毒性及蛋白酶体效应
　　Pyrithione（0.25μM-1.0μM）与过氧化氢联合作用后细胞活力明显下降，PI染色阳性细胞数明显增多，Annexin V-FITC流式细胞术示细胞死亡率增多，但Western blot结果显示反映UPS系统内源性的蛋白Ub未见明显的聚集增多。
　　3.Pyrithione铜盐肿瘤细胞的毒性及蛋白酶体效应
　　3.1 Pyrithione铜盐对肿瘤细胞的毒性效应
　　3.1.1 Pyrithione铜盐（0.08μM-1.0μM）作用于MCF-7细胞后，细胞活力明显下降，其IC50值约在0.25μM，细胞形态Annexin V-FITC阳性细胞数明显增多。
　　3.1.2 Pyrithione铜盐（0.08μM-1.0μM）作用于U266细胞后细胞活力明显下降，其IC50值约在0.25μM，细胞形态PI染色阳性细胞数增多，0.5μM-1.0μM Annexin V-FITC流式细胞术示细胞死亡率分别为：47%、64%、80%。
　　3.2 Pyrithione铜盐对蛋白酶体的抑制作用
　　3.2.1 Pyrithione铜盐（0.0625μM-1.0μM）作于人乳腺癌细胞MCF-7、人骨髓瘤细胞U266后，对细胞内的蛋白酶体活性有明显的抑制作用，并呈浓度依赖的关系。
　　3.2.2 Pyrithione铜盐（0.25μM-0.75μM）作于MCF-7细胞、U266细胞、稳定转染GFPu的HEK-293细胞后，，反映UPS系统的内源性蛋白Ub以及外源性蛋白GFPu呈浓度依赖及时间依赖性聚集。
　　结论：
　　1. Pyrithione能抑制细胞内蛋白酶体活性并诱导细胞毒性。
　　2. Pyrithione与CuCl2联合能诱导肿瘤细胞死亡，这种细胞死亡作用可能与蛋白酶体功能抑制和Caspase系统的活化相关。
　　3. Pyrithione与过氧化氢联合能增强细胞毒性作用增强，而不增强蛋白酶体功能的抑制。
　　4. Pyrithione铜盐能抑制细胞内蛋白酶体活性并诱导肿瘤细胞死亡。

目录

封面

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中英文对照词表

中文摘要

英文摘要

前 言

材料与方法

一、细胞株

二、实验材料

三、实验用仪器

四、主要溶液配制

五、实验步骤

实验结果

1. Pyrithione与CuCl2联合对肿瘤细胞的毒性及蛋白酶体抑制效应

2. PO与过氧化氢联合对U266细胞的毒性及蛋白酶体效应（图6）

3. Pyrithione铜盐对细胞的毒性及蛋白酶体效应

讨论

结论

附 图

参考文献

综述

致谢

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