头孢曲松低敏淋病奈瑟菌的分子流行病学及耐药基因研究

摘要

[目的]
　　 了解深圳地区淋病奈瑟菌（淋球菌）对头孢曲松的耐药现状;采用淋球菌多抗原序列分型(Neisseria gonorrhoeae multiantigen sequence typing，NG-MAST)分子分型的方法结合患者的信息资料，了解本地区头孢曲松低敏淋球菌菌株的流行特征;初步探讨penA、ponA、porB、mtrR四种基因突变在介导淋球菌对头孢曲松低敏中的作用，为本地区淋病的防治提供参考依据。
　　 [方法]
　　 1.采用琼脂稀释法，对深圳地区淋球菌临床分离株进行头孢曲松最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）测定，分析淋球菌临床分离株对头孢曲松的耐药现状;
　　 2.收集患者的信息资料，进行Logistic回归分析，分析头孢曲松低敏淋球菌感染的相关因素;
　　 3.应用NG-MAST分子分型方法对头孢曲松低敏的淋球菌菌株分析，分析该类菌株的序列型(sequencetype，ST);
　　 4.采用MEGA4软件，建立邻接法(Neighbor-Joining，NJ)进化树，用于ST集群间的遗传相关性分析;
　　 5.对头孢曲松低敏的淋球菌菌株的penA、ponA、porB及mtrR基因进行扩增测序，初步探讨四种基因突变在介导淋球菌对头孢曲松低敏中的作用。
　　 [结果]
　　 1.2009年～2011年共收集到296株淋球菌，患者均为汉族，以已婚异性恋青壮年男性为主，感染途径主要来自婚外性行为，大部分(87.5％)患者否认有抗生素使用史，主诉无淋病病史，泌尿生殖道有异常分泌物。未发现有对头孢曲松耐药的菌株，但头孢曲松低敏菌株有53株(17.9％)。产β-内酰胺酶菌株(penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae，PPNG)共97株(32.8％)。三年间，淋球菌对头孢曲松的低敏比例、半数抑菌浓度（50％ minimal inhibitoryconcentration，MIC50）及90％抑菌浓度（90％ minimal inhibitory concentration， MIC90)未见明显改变。
　　 2.将头孢曲松低敏组（53株）与高敏组（243株）患者的人口学特征进行比较，仅发现近两个月的抗生素使用史与头孢曲松低敏淋球菌感染相关(OR=3.080,95％CI:1.376～6.894)。
　　 3.共对106株淋球菌菌株（包括53株头孢曲松低敏淋球菌菌株和按照1∶1抽样原则随机抽取的53株高敏菌株）进行了NG-MAST基因分型，得到了89个ST型别(包括14个成簇的ST和75个单一的ST)。其中53株头孢曲松低敏淋球菌的NG-MAST基因分型共得到了48个ST型别，由5个成簇的ST(ST1768、ST3927、ST641、ST7076、ST7078各包含了2株淋球菌)和43个单一的ST构成;其中22个为新发现的，其余26个ST型别包括3个成簇的ST(ST1768、ST3927、ST641)则分别被香港、加拿大、英国、澳大利亚、南非等报道过;有9个ST型别也存在于高敏株中。
　　 4.由por和tbpB基因序列串联构成的系统进化树，平均遗传距离为0.731核苷酸差异，最大遗传距离为2.303核苷酸差异，分别存在于ST2422与ST7080和ST5167与ST6991之间。89个ST型别被0.95633核苷酸差异分成了两个大群，但未观察到低敏株单独成簇的情况。
　　 5.对106株淋球菌临床分离株的penA基因测序，共得到17个不同的氨基酸模式。除了模式X具有镶嵌样结构，其余16个模式的氨基酸突变主要存在于500到580位氨基酸。其中，10个氨基酸模式Ⅱ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、(XⅢ)、Ⅻ、(XⅧ)、(XXⅠ)曾被Ito和Whiley报道过，而剩余的7个氨基酸模式(XXXⅦ)～(XXXXⅢ)为本次研究新发现。模式(XⅧ)数量最多为23株。106株菌中有105株菌的青霉素结合蛋白2(penicillin-binding protein2，PBP2)在345位存在天冬氨酸的插入(Asp-345a)。
　　 6.每种PBP2氨基酸模式所含菌株对应的头孢曲松MIC值分布具有多样性。主要的6个氨基酸模式(XⅧ)、(XⅢ)、(XXXⅧ)、(XXⅠ)、Ⅱ、Ⅴ对应的头孢曲松MIC值相对较高，而模式Ⅱ的头孢曲松MIC值相对较低。MIC值相对较高的三个氨基酸模式均具有A501V或A501T突变，而MIC值相对较低的模式Ⅱ不具有。对105株菌（具有镶嵌样结构模式Ⅹ的1株菌除外）的表型与501位点氨基酸突变分析发现，随着MIC值的增加，其501位点氨基酸突变的比例也在上升。
　　 7.106株菌的mtr、porB和ponA基因突变在头孢曲松低敏株与高敏株中未见明显差异。
　　 [结论]
　　 1.2009年～2011年深圳地区淋球菌对头孢曲松的耐药趋势未见明显增加，头孢曲松仍可作为治疗淋病的首选药物。患者人口学特征与分布的稳定，有利于有效的开展淋球菌的防控工作。
　　 2.深圳地区头孢曲松低敏淋球菌的流行存在独特的特点。NG-MAST分型中较多单一ST型别的出现说明存在大量未被诊断和监测的淋病患者;深港两地较多相同ST型别的出现，表明两地存在复杂的淋病传播网络。因此我们应加强监测，预防低敏菌株的广泛传入或传出。
　　 3.仅近两个月的抗生素使用史与头孢曲松低敏淋球菌感染有关及NJ进化树未观察到低敏株单独成簇的情况表明抗生素选择性压力导致的耐药基因突变是导致头孢曲松低敏淋球菌出现的主要原因，而非单个菌株的克隆化传播所致。
　　 4.penA镶嵌样结构并不是导致深圳地区淋球菌对头孢曲松低敏的主要原因，非镶嵌样penA基因500到580位氨基酸突变尤其是501位氨基酸的突变可能在介导本地区淋球菌对头孢曲松低敏中发挥了重要作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 琼脂稀释法体外测定淋病奈瑟菌对头孢曲松的敏感性

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

3 2009年~2011年深圳地区头孢曲松低敏淋病奈瑟菌的流行特征分析

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

4 头孢曲松低敏淋病奈瑟菌的耐药基因分析

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

5 小结

参考文献

淋病奈瑟菌对头孢曲松耐药性及敏感性降低机制研究进展

致谢

附录一 技术路线图

附录二 缩写中英文对照

附录三 淋球菌菌株及患者信息收集表

附录四 SPSS应用程序

附录五 序列比对的参照序列

附录六 使用的软件

附录七 在读硕士期间的科研、教学及获奖情况