LRH-1在尼罗罗非鱼雌激素生成和卵子发生中的作用

摘要

肝受体同系物-1（liver receptor homolog-1, LRH-1, NR5A2），隶属于核受体NR（nuclear receptor）5A亚家族，是一种重要的转录因子。LRH-1的结构在脊椎动物中十分保守。其在机体代谢、发育、胆汁酸动态平衡和类固醇生成中起着重要的作用。
　　LRH-1在垂体、肾上腺、脂肪、胰腺、肝脏、肠道、精巢、卵巢等器官中表达。在哺乳动物中，LRH-1主要表达在各发育阶段卵巢的滤泡颗粒细胞（Granulosa cells）和黄体细胞中，在鞘膜细胞（Theca cells）中没有表达；在精巢生殖细胞和莱氏细胞（Leydig cells）中有表达，在支持细胞（Sertoli cells）中没有表达。在小鼠中，LRH-1纯合敲除致死。杂合突变雄鼠的附睾和精囊体重比正常小鼠低，Star、Scc、3β-HSD等类固醇生成因子表达含量下降；杂合突变LRH-1雌鼠由于Star、Cyp19a1等类固醇基因表达水平降低而导致小鼠不能排卵。颗粒细胞特异性条件敲除LRH-1雌鼠不育，不能排卵。在硬骨鱼类中，利用RT-PCR的方法证实了LRH-1在脑、垂体、鳃丝、鳔、肝脏、肠道、脂肪、血液、卵巢以及肾脏和头肾中均有表达。在石斑鱼中，LRH-1表达在卵巢的滤泡细胞和生殖细胞中。有体外实验证明LRH-1可以结合在cyp19a1a和cyp19a1b的启动子上并激活它们的表达。在脊椎动物中，至今没有LRH-1在小鼠以外的功能研究报道，也没有对罗非鱼LRH-1的表达和功能进行系统的研究报道。
　　在本研究中，利用RT-PCR，Western blot以及免疫组织化学方法研究了LRH-1在罗非鱼不同组织和雌雄性腺不同发育阶段中的表达以及细胞定位；并利用CRISPR/Cas9系统对尼罗罗非鱼中的LRH-1进行突变，获得了F0代阳性鱼和F1代杂合子，进一步研究了LRH-1在性腺中的作用。研究结果如下：
　　通过中山大学张为民教授实验室获得斑点石斑鱼LRH-1抗体，利用ClustalX软件对用于制作石斑鱼LRH-1多克隆抗体的抗原氨基酸序列（172-288）和罗非鱼肝受体同系物-1（liver receptor homolog-1, LRH-1, NR5A2），隶属于核受体NR（nuclear receptor）5A亚家族，是一种重要的转录因子。LRH-1的结构在脊椎动物中十分保守。其在机体代谢、发育、胆汁酸动态平衡和类固醇生成中起着重要的作用。
　　LRH-1在垂体、肾上腺、脂肪、胰腺、肝脏、肠道、精巢、卵巢等器官中表达。在哺乳动物中，LRH-1主要表达在各发育阶段卵巢的滤泡颗粒细胞（Granulosa cells）和黄体细胞中，在鞘膜细胞（Theca cells）中没有表达；在精巢生殖细胞和莱氏细胞（Leydig cells）中有表达，在支持细胞（Sertoli cells）中没有表达。在小鼠中，LRH-1纯合敲除致死。杂合突变雄鼠的附睾和精囊体重比正常小鼠低，Star、Scc、3β-HSD等类固醇生成因子表达含量下降；杂合突变LRH-1雌鼠由于Star、Cyp19a1等类固醇基因表达水平降低而导致小鼠不能排卵。颗粒细胞特异性条件敲除LRH-1雌鼠不育，不能排卵。在硬骨鱼类中，利用RT-PCR的方法证实了LRH-1在脑、垂体、鳃丝、鳔、肝脏、肠道、脂肪、血液、卵巢以及肾脏和头肾中均有表达。在石斑鱼中，LRH-1表达在卵巢的滤泡细胞和生殖细胞中。有体外实验证明LRH-1可以结合在cyp19a1a和cyp19a1b的启动子上并激活它们的表达。在脊椎动物中，至今没有LRH-1在小鼠以外的功能研究报道，也没有对罗非鱼LRH-1的表达和功能进行系统的研究报道。
　　在本研究中，利用RT-PCR，Western blot以及免疫组织化学方法研究了LRH-1在罗非鱼不同组织和雌雄性腺不同发育阶段中的表达以及细胞定位；并利用CRISPR/Cas9系统对尼罗罗非鱼中的LRH-1进行突变，获得了F0代阳性鱼和F1代杂合子，进一步研究了LRH-1在性腺中的作用。研究结果如下：
　　通过中山大学张为民教授实验室获得斑点石斑鱼LRH-1抗体，利用ClustalX软件对用于制作石斑鱼LRH-1多克隆抗体的抗原氨基酸序列（172-288）和罗非鱼的LRH-1相应蛋白氨基酸序列进行比对，发现石斑鱼抗原部分98％的氨基酸序列都可以比对到罗非鱼的蛋白氨基酸序列上。证明石斑鱼的LRH-1抗体可以用来检测罗非鱼的LRH-1蛋白。我们通过Western blot结果显示：石斑鱼的LRH-1多克隆抗体能特异识别罗非鱼的LRH-1天然蛋白（85 kDa），并发现LRH-1在罗非鱼的精巢、卵巢中均有一条主带，且在心脏、脑、肝脏中表达。RT-PCR结果显示LRH-1可在罗非鱼脑、鳃丝、心脏、脾、肝脏、肠、卵巢、精巢、肌肉等组织中表达。此外，免疫组化结果显示：LRH-1主要表达在早期生殖细胞和类固醇生成细胞，在卵巢中表达于卵原细胞、卵母细胞、间质细胞和鞘膜细胞，在精巢中表达于精原细胞、精母细胞和莱氏细胞。且LRH-1与Cyp19a1a/Cyp17a1/Cyp17a2共表达于卵巢的间质细胞和鞘膜细胞。LRH-1和Sf-1表达模式基本一致。
　　利用CRISPR/Cas9技术在尼罗罗非鱼突变LRH-1基因，获得F0代XX与XY的阳性鱼，尾鳍突变率最高为98%，最低为50%。对F0代阳性鱼分析表明：与对照XX雌鱼相比，120 dah时，XX阳性鱼卵巢出现空腔，且Cyp19a1a/cyp19a1a、scc、starI表达下调。同时，通过EIA检测显示，XX阳性鱼雌激素水平下调；210 dah时，XX阳性鱼卵巢相比对照组卵巢表现为发育延迟，卵巢中还保留大量类固醇阳性细胞。通过LRH-1突变的阳性F0代XY雄鱼与野生型XX雌鱼杂交产生F1代杂合子LRH-1+/-。性腺组织检测结果表明，与对照雌鱼相比，在90 dah LRH-1+/-XX雌鱼卵巢中，间质细胞减少，Cyp19a1a/cyp19a1a表达下调，雌激素水平下调。在210 dah LRH-1+/-XX雌鱼卵巢中，卵子发育延迟，有大量卵母细胞停留在I、II时相，迟迟不能积累卵黄，且有空腔出现，卵巢性腺成熟系数（GSI）显著降低；与对照XY雄鱼相比，90 dah时，LRH-1+/-XY雄鱼精巢内部结构紊乱，但在180 dah时精巢内部恢复正常，产生的精子可育。精巢芳香化酶Cyp19a1b/cyp19a1b表达下调，雌激素水平下调，雄激素水平没有显著变化。由于F1代雌鱼不育，所以尝试用两种方法建立LRH-1纯合突变鱼，第一种方法为用F0代LRH-1突变雌鱼和F0代突变雄鱼杂交，尝试在杂交后代中筛选纯合子；第二种方法为用F0代突变雌鱼和F1代突变雄鱼杂交，尝试在杂交后代中筛选纯合子，但酶切结果显示杂交后代均为杂合子和野生型，没有发现纯合子，表明纯合突变致死。
　　综上所述，本研究结果证实在罗非鱼性腺中LRH-1的表达模式与哺乳动物基本一致：在生殖细胞和类固醇生成细胞中表达。并且在硬骨鱼类雌激素生成和卵子生成中具有重要作用。这反映出LRH-1在脊椎动物中的表达和功能具有保守性。

目录

声明

中英文缩略语对照表

1. 文献综述

1.1 脊椎动物卵子发生及调控

1.1.1 下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴

1.1.2 卵子发生

1.2 LRH-1简介

1.2.1 LRH-1在性腺的表达

1.2.2 LRH-1在性腺的功能研究

1.2.3 LRH-1与类固醇生成

1.3 科学问题的提出和本研究的目的意义

2. LRH-1性腺表达初步研究

2.1 引言

2.2 实验材料和仪器

2.2.1 实验动物

2.2.2 实验试剂和仪器

2.2.3 试剂配制

2.2.4 实验方法

2.3 结果

2.3.1 LRH-1抗体检测以及性腺细胞定位

2.3.2 LRH-1和Cyp19a1a共表达

2.3.3 LRH-1和Cyp17a1/Cyp17a2共表达

2.3.4 LRH-1和Sf-1在性腺中的表达异同

2.4 讨论

2.4.1 LRH-1在性腺中的表达

2.4.2 LRH-1和Cyp19a1a/Cyp17a1/Cyp17a2在卵巢中共表达

2.4.3 LRH-1和Sf-1在性腺中的表达异同

3. LRH-1功能的初步研究

3.1 引言

3.2实验材料和仪器

3.2.1 实验动物

3.2.2 实验试剂和仪器

3.2.3试剂配制

3.2.4实验方法

3.3 结果

3.3.1 LRH-1 F0/F1代突变鱼的获得和纯合突变鱼的获得尝试

3.3.2 LRH-1 F0代突变对雌鱼的影响

3.3.3 LRH-1 F1代突变对性腺的影响

3.4 讨论

3.4.1 LRH-1纯合突变致死

3.4.2 LRH-1在卵巢中促进雌激素表达

3.4.3 LRH-1在精巢中调控雄性芳香化酶基因的表达

3.4.4 LRH-1与类固醇生成

3.4.5 LRH-1与配子发生

3.4.6 LRH-1与SF-1在罗非鱼性腺中的功能比较

结论与展望

参考文献

致谢

在读期间所发表的文章