红笛鲷人工感染溶藻弧菌后的组织学研究及斑点杂交检测方法的建立

摘要

本文对红笛鲷人工感染溶藻弧菌后的病变组织结构进行显微观察，研究了组织结构的病理变化。10％中性福而马林固定，石蜡包埋，5-7um切片，常规HE染色，显微镜观察。结果表明，注射溶藻弧菌后的红笛鲷表现出一系列临床症状：体表充血，体色发白，平衡能力低，运动迟缓，注射部位出现红肿，腹部膨大，打开腹腔可见明显的积水，肝脏出血，脾脏肿大，肠道内无食物。取刚刚死亡或者濒临死亡红笛鲷的肝脏、脾脏、肠、心脏等组织制备病理组织切片，显微观察发现这些组织均发生病变，其中尤以肝脏和脾脏病变最为明显。肝脏出血，肝索中有红细胞浸润，部分肝细胞坏死，解体；脾脏中细胞结构不明显，细胞坏死，；肠粘膜上皮细胞脱落、坏死，微绒毛模糊不清。对溶藻弧菌注射红笛鲷后的主要病理组织进行取样，10％中性福而马林固定，冰冻切片，ABC免疫组化检测，结果表明，所检组织(肝、脾、肠)中均有大量棕黄色阳性颗粒出现，表明溶藻弧菌已侵染红笛鲷各个组织并在各个组织大量繁殖，而未注射溶藻弧菌的健康红笛鲷则无阳性颗粒出现或很少。参照上述研究及检测结果，从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶和外膜蛋白基因序列，根据基因的保守性用DNAStar分别设计两对引物，分别进行PCR扩增，然后对该特异DNA片段进行克隆、测序，与Genbank里已知的溶藻弧菌胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列进行同源性比对，根据比对结果将回收的特异DNA片段通过地高辛标记制备成探针。分别应用溶藻弧菌的胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针，对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测。检测结果表明，胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应，而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无阳性反应，表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强；而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应，但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA也出现了较强的阳性反应，与霍乱弧菌DNA则无阳性反应，表明该外膜蛋白。DNA探针的特异性较低。因此本文构建的溶藻弧菌胶原蛋白酶DNA探针斑点杂交检测方法，特异性强，简便易行，为溶藻弧菌的快速诊断提供一种新的检测方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词

声明

第一章文献综述

1鱼类弧茵病的研究概况

2弧菌的生理生化特性

3溶藻弧菌的研究概况

4弧菌的毒力因子与毒力基因研究现状

4.1鞭毛

4.2粘附因子

4.3碱性丝氨酸蛋白酶(Alkaline Serine Protease)

4.4胶原蛋白酶(Collagenase)

4.5溶血素(Hemolysin)

4.6载铁体(Siderophore)

4.7其他胞外产物

4.8内毒素

4.9膜蛋白

5弧菌的主要检测技术

5.1传统检测方法

5.2自动鉴定方法

5.3荧光抗体技术

5.4免疫酶技术

5.5 PCR(聚合酶链反应)技术

5.6核酸杂交检测技术

5.7其它检测技术

6研究目的及意义

第二章红笛鲷人工感染溶藻弧菌后的组织病理学以ABC免疫组化的研究

1材料和方法

1.1实验材料

1.2主要试剂

1.3 实验仪器及设备

1.4实验方法

2结果

2.1小白鼠攻毒试验结果

2.2溶藻弧菌感染红笛鲷后症状观察

2.3 ABC免疫组化结果

3讨论

第三章地高辛标记的DNA探针制备及其应用于溶藻弧菌的检测

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果

2.1溶藻弧菌基因组提取结果

2.2胶原蛋白基因和外膜蛋白基因扩增结果

2.3两段特异DNA片段连接至pMD18-T后质粒提取结果

2.4 PCR鉴定结果

2.5测序及同源性比对结果

2.6探针的标记效率检测结果

2.7探针特异性检测结果

2.8人工感染检测结果

3讨论

结论

致谢

参考文献

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