深海嗜热微生物噬菌体GVE2裂解相关蛋白的性质研究

摘要

深海热液口微生物作为地球生物系统的重要组成部分，对于生态、资源、环境等方面具有重要性，在新药物开发等工业方面也存在巨大的潜在应用价值。过去普遍认为微生物是决定生物群落的关键，但是在极端与相对原始的深海环境下发现了噬菌体的存在，证明噬菌体实际上起到更基础的作用。对热液口嗜热菌噬菌体的研究，不仅有助于了解噬菌体在控制热液口生物群落中所起的作用，而且对探索生命起源也具有重要的意义。噬菌体裂解导致细菌死亡，从而影响细菌的繁殖，进而影响食物链，故研究其具有重大意义。 本文以本实验室分离获得的深海热液区嗜热菌噬菌体GVE2为材料，研究与裂解相关的细胞壁水解酶和膜孔形成蛋白这两个蛋白的性质。 许多发现表明细胞壁水解酶的作用范围比噬菌体的宿主范围要广，但也局限于同属细菌，且发现amidases具有较广的裂解范围。因为N—乙酰胞壁酸和L—丙氨酸键广泛存在细菌的细胞壁上。噬菌体裂解酶对细菌的高特异性，不影响无害或有益的人体寄生菌，裂解酶作为新型抗菌药物具有一定的优势，噬菌体作为有价值的酶的来源也就越来越引起人们的重视。大部分细胞壁水解酶来自常温噬菌体，只有小部分来自嗜热细菌噬菌体。本试验从海洋嗜热细菌噬菌体GVE2中鉴定的GVE2细胞壁水解酶是一种酰酶。本论文中，重组的细胞壁水解酶最适温度是60℃，该酶从40到80℃都具有活性。它的最适pH是6．0，并且从pH4．0到10．0较广的耐受。重组酶在pH5．0—10．0耐受1小时后仍保持50%的活性，说明GVE2细胞壁水解酶有较好的弱酸耐受性。对于去污剂和抑制剂（用chaps，EDTA，PMSF，Tween—20，TritonX—100，SDS），结果表明Tween—20和TritonX—100对酶的影响不大，但是SDS和EDTA对酶的活性具有强抑制作用。金属离子方面的研究结果显示，K+、Li+、Na+对酶的活性有促进作用，Mn2+、Ca2+、Zn2+、Ba2+、Mg2+对酶的活力有负面影响。 在双链DNA噬菌体中，细胞壁水解酶本身没有信号肽，需要通过膜孔形成蛋白介导到达细胞壁，从而裂解宿主。通过Far—Western研究，结果显示GVE2细胞壁水解酶和膜孔形成蛋白存在互作，进一步采用细菌双杂交进行试验，结果表明膜孔形成蛋白全长与细胞壁水解酶81—233aa区域存在互作。 本文通过GST pull down、免疫共沉淀研究，发现宿主的ABC运输蛋白、乙醇脱氢酶锌指结合蛋白和EF—Tu蛋白与GVE2细胞壁水解酶存在蛋白互作，克隆了ABC运输蛋白和EF—Tu基因，细菌双杂交试验显示细胞壁水解酶可能与复合体中的乙醇脱氢酶锌指结合蛋白或/和ABC运输蛋白存在互作。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1高温噬菌体研究进展

1.2噬茵体裂解机制

1.3高温细菌噬菌体GVE2的基本特征

1.4细菌双杂交

1.5本论文研究目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1 GVE2细胞壁水解酶的性质研究

3.1.1 GVE2细胞壁水解酶基因的序列分析

3.1.2 GVE2细胞壁水解酶基因的重组表达和纯化

3.1.3 GVE2细胞壁水解酶重组蛋白的抗体制备

3.1.4 GVE2细胞壁水解酶基因的转录表达分析

3.1.5 GVE2细胞壁水解酶的酶学性质

3.2 GVE2膜孔形成蛋白的性质研究

3.2.1 GVE2膜孔形成蛋白基因的序列分析及其表达和纯化

3.2.2 GVE2膜孔形成蛋白基因的转录分析

3.3 GVE2细胞壁水解酶和GVE2膜孔形成蛋白相互作用的分析

3.3.1 Far-Western验证GVE2细胞壁水解酶和GVE2膜孔形成蛋白互作

3.3.2细菌双杂交系统验证GVE2细胞壁水解酶和GVE2膜孔形成蛋白互作区域

3.4 GVE2细胞壁水解酶与宿主互作蛋白的研究

3.4.1互作蛋白的筛选与鉴定

3.4.2互作蛋白的基因克隆及序列分析

3.4.3细菌双杂交系统验证EF-Tu与GVE2细胞壁水解酶的互作

4讨论

5小结与展望

参考文献

附录：

致谢