坦布苏病毒PS株全长感染性克隆的构建与病毒拯救

摘要

坦布苏病毒（TMUV）最早分离于马来西亚蚊子中，随后在2002年泰国鸭血清中同样分离到该病毒，但当时均未见其对人和动物存在致病性。然而，自2010年以来，TMUV感染却成为危害我国养鸭业的主要疾病之一。序列分析显示，我国鸭源TMUV与早期蚊源毒株具有较大的基因序列差异。由此可见，TMUV的基因变异可能是其致病性发生改变的主要原因。本研究旨在以TMUV PS株为材料，构建全长感染性克隆，以便为深入研究该病毒的复制以及致病机制提供技术平台。将转录本RNA转染BHK-21细胞96 h后，可见细胞病变。用RT-PCR可从第7代培养物中检出TMUV核酸。测序结果证明，除遗传标记基因外，拯救病毒基因组序列与PS株原始序列一致。IFA结果显示，拯救病毒感染的BHK-21细胞可产生特异性的荧光信号。另外，病毒感染BHK-21细胞的生长曲线显示，拯救病毒和亲本毒具有相似的生长趋势和病毒滴度。以上结果表明坦布苏病毒PS株全长感染性克隆构建成功。据文献报道，构建黄病毒感染性克隆时，病毒序列在宿主菌中易发生突变，因此，难以获得稳定的全长克隆。本研究先后选用几种低挎贝质粒和宿主菌，亦未能构建出覆盖基因组全长的cDNA克隆。而改用融合PCR方法则扩增得到了TMUV PS株的全长cDNA，并且除遗传标记基因以外所拯救病毒序列与亲本毒株序列完全一致。