L-肌肽的酶法绿色合成

摘要

左旋肌肽[L-carnosine]是由β-丙氨酸和L-组氨酸缩合得到的活性二肽,被广泛用作于化妆品、药品和保健品添加剂.目前工业上肌肽的制备主要通过化学法完成,其中邻苯二甲酸酐法技术相对成熟,应用比较广泛,但此法溶剂消耗较大,副产物较多,环境污染较严重.已报道的生物酶法合成肌肽的技术,主要以β-丙氨酰胺与L-组氨酸为底物,以重组β-氨肽酶整细胞为催化剂,产量最高为3.7g/L,但现在市场上β-丙氨酰胺的价格与L-肌肽基本持平,是β-丙氨酸的40倍,因此采用该技术进行肌肽的合成,成本非常高,缺乏工业化生产的可能性.本课题组以生物体内广泛存在的肌肽水解酶为催化剂，催化β-丙氨酸和L-组氨酸的酶法缩合，一步直接合成肌肽。以来源于原核生物的二肽水解酶VaPepD为探针，通过基因组挖掘，获得合成活力是探针7倍的二肽水解酶SmPepD，动力学常数表明SmPepD对L-HisOH的kcat/Km是探针的6.4倍。SmPepD最适pH为8.0，在40°C的半衰期超过72h，表现出良好的热稳定性。在此基础上，对SmPepD进行了定向进化改造，以OPA衍生化荧光检测法，筛选获得对L-HisOH的kcat/Km提高2.2倍的突变体M1。对反应pH、温度、底物浓度及比例进行了系统优化，优化后的条件为：两底物饱和时，以Tris-HCl(50m M,pH8.0)缓冲液，40°C搅拌反应。在2L反应釜中进行肌肽的合成，转化72h，产物肌肽浓度达到15.2g/L。该路线中无需对原料进行衍生化处理，并且无需使用任何有机溶剂，是一条绿色环保的L-肌肽合成工艺路线。