三重SYBRGreen Ⅰ实时荧光定量PCR与ELISA检测弓形虫的比较

摘要

目的：本研究选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为real-time PCR检测的靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。方法：将529bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆测序构建标准品;将构建的3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR.结果：529bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数(R2)均为0.998,并且扩增效率均为96.724％;通过溶解曲线分析可以确定529bp、ITS-1和B1扩增的片段的Tm值分别为86.7±0.5℃、78.8±0.5℃、83.1±0.5℃;特异性试验表明,529bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值,阴性对照无扩增曲线;敏感性试验表明,529bp、ITS-1和B1序列最低检出限为173copies/μL、123copies/μL和135 copies/μL;Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.13％;ELISA检测猪弓形虫IgG抗体检测阳性率41.72％,ELISA与荧光定量PCR检测核酸阳性符合率为53.44％(P<0.01)三重SYBRGreenⅠReal-time PCR检测的阳性率根据靶基因在基因组中的拷贝数不同,检测的阳性率略有不同,529bp为35.67％、ITS-1为33.44％、B1为33.12％,并且检测ELISA的假阴性率也略有不同,529bp为8.06％、ITS-1为4.84％、B1为4.03％。