icroRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响

摘要

目的：构建靶向梅花鹿胰岛素样生长因子1(IGF1)基因的microRNA真核表达载体,研究microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响. 方法：根据IGF1mRNA序列设计并合成4对pre-microRNA前体片段,定向克隆于pcD-NA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-1,pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2,pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-3和pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGFl-miR-4.测序分析插入序列的完整性;将重组质粒转染鹿茸软骨细胞,利用相对荧光定量PCR技术检测IGF1基因mRNA的表达量;在此基础上选择表达量最低的pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒转染鹿茸软骨细胞,Western blotting分析IGF1的蛋白表达水平,MTT法和流式细胞仪检测重组质粒对鹿茸软骨细胞体外增殖和细胞周期的影响. 结果：测序结果显示,构建的4组重组质粒插入片段的碱基序列完全正确.转染pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒后,鹿茸软骨细胞中IGF1基因mRNA的表达水平均有所下降,其中转染pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2组的表达水平最低,筛选出pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2组为最佳干扰靶点质粒.与对照组比较,IGF1的蛋白表达水平降低;pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2转染组的鹿茸软骨细胞的增殖受到抑制,细胞周期S期细胞百分比减少,表明鹿茸软骨细胞停滞在G0/G1期. 结论：梅花鹿IGF1的表达水平受miRNA的调控,表明在鹿茸快速生长过程中miRNA具有重要的调控作用.