快速检测非洲猪瘟病毒环介导等温扩增方法的建立

摘要

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Afi-ican swine fever virus,ASFV)引起的一种高致病率和死亡率的急性、烈性、接触性的传染病,强毒株感染后导致动物100％的死亡率,而目前对于非洲猪瘟的治疗和疫苗的防控还没有有效措施,现行对该病防控措施最主要的仍是检疫,一旦检测到该病存在,一律对动物进行严格扑杀并采取无害化处理.我国目前虽然尚无非洲猪瘟疫病的发生,但是随着日渐频繁的进出口贸易发展,以及人员流动的来往,该病传入我国的可能性也随之增大.为了能及时的检测出非洲猪瘟,预防该病传入我国,因此建立一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的检测方法显得尤为重要. 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplifcation,LAMF.)作为一种新型的核酸检测技术,在短短的十几年时间快速的发展,由于该方法具有快速灵敏,特异性好,操作简便,结果便于判定,并且不需要特殊检测仪器等特点,已经广泛应用于各种细菌、病毒和寄生虫的检测中,在动物的胚胎性别鉴别、食品卫生检疫、基因芯片的开发研究方向等也有应用,是最有发展前景的快速诊断方法之一. 本试验根据NCBI已登录的非洲猪瘟K205R基因序列,人工合成该基因质粒作为试验所需模板.通过在线软件,根据LAMP引物设计原理,针对非洲猪瘟病毒K205R基因序列设计了一套特异性引物,在进行反应条件优化后成功建立了非洲猪瘟病毒的LAMP检测方法.通过对反应产物的鉴定分析,灵敏度试验以及和常规PCR方法进行对比,结果表明所建立的非洲猪瘟LAMP检测方法可检出低于10拷贝数的非洲猪瘟病毒DNA,其灵敏度高于常规PCR方法100倍,且特异性和稳定性良好.此方法简单、快速,在恒温水浴锅中63℃反应45min即可完成.反应产物除通过琼脂糖凝胶电泳分析外,还可进行可视化检测,阳性反应管在自然光下变得浑浊,加入荧光染料在紫外灯照下有绿色荧光的出现.该试验成功建立了快速检测非洲猪瘟病毒环介导等温扩增的方法,是一种适用于实验室和现场快速检测的方法,本试验方法的建立为我国预防非洲猪瘟疫病的传入提供了参考.