SIK1信号通路在高糖培养HepG2细胞中的表达及对糖异生的影响

摘要

目的：本实验采用体外培养的HepG2细胞,构建人SIK1基因的真核表达载体,从细胞和分子水平,对高糖环境下HepG2细胞内SIK1的表达变化、对CRTC2及其下游糖异生通路的调控进行研究.rn 方法：采用人肝癌(HepG2)细胞,高糖组细胞用高糖(培养基中含25mmol/L glucose)培养,设立正常糖组,培养基中含正常浓度的糖(5mmol/L glucose),细胞培养24h后收集细胞,进行后续检测.同时,构建了携带SIK1基因的重组质粒pGV230-SIK1,以及空质粒、即Vector.采用阳离子脂质体转染法转染肝细胞后加入完全培养基培养48h,之后,分别加入正常糖和高糖培养基培养24h,收集细胞,进行后续检测.主要检测指标：RT-PCR检测细胞SIK1mRNA的表达,Western Blot检测SIK1信号通路相关基因的蛋白表达及磷酸化水平;细胞免疫荧光法观察高糖刺激下细胞内生性及转染SIK1的分布及核质转移的情况;免疫化学检测高糖对HepG2细胞内糖异生基因的表达;检测细胞培养液中葡萄糖含量.rn 结果：高糖培养HepG2细胞24h，与正常糖组相比，高糖组细胞的SIK1蛋白表达水平降低了77.6%;pT182-SIK1磷酸化水平降低66.3%；高糖组细胞的PEPCK表达明显增高细胞内的SIKI阳性信号明显从细胞质转移到细胞核，且信号表达明显减弱，高糖组细胞培养液中葡萄糖和细胞TG含量显著升高。rn 结论：①高糖刺激能够抑制SIK1的活性,肝细胞糖异生的通路激活,导致肝细胞糖异生增多;②增加SIK1的表达可减少肝细胞过多的糖异生;③高糖环境SIK1由细胞质向细胞核转移,虽然SIK1进入细胞核,但由于其蛋白表达和反映其活性的pT182SIK1磷酸化水平降到极低,在核内无能调控生糖基因;而高表达SIK1后,SIK1向细胞核转移,入核可磷酸化目的基因,可见pS171CRTC2磷酸化水平明显上调.