三角褐指藻△15脂肪酸去饱和酶的基因克隆及功能研究

摘要

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一种富含EPA(eicosapentaenoic，EPA，20：5n-3)的海洋单细胞硅藻，其EPA含量可达到总脂肪酸的30％，说明这种藻存在高效合成EPA的酶系，成为研究微藻EPA生物合成的模式材料。2007年，Joint Genome Institute，Department of Energy，USA用Shotgun技术完成了这个藻的全基因组测序，把有关结果公布在http：／／genome．jgi-psf．org／上。本实验以三角褐指藻为研究材料，用具1，3-位专-性水解作用的脂肪酶和油包水(W／O)微乳液系统对三角褐指藻贮存脂质TAG进行脂肪酸分布的定位分析，结果显示，EPA在甘油的三个位置都有分布，但2位上分布量较少，在1，3位上分布较多。这说明三角褐指藻的储存油脂对人体具有较大的营养价值。用一个已经在海链藻(Thalassiosira pseudonana)中鉴定的△15位脱饱和酶基因的氨基酸序列在三角褐指藻的全基因组测序数据库(http：／／genome．jgi—psf．org／)中做生物信息学分析，得到3个相关的非全长序列，通过对所得序列进一步生物信息学分析，发现其中两个序列分别编码了两个已知的△12去饱和酶;另一个序列为未知序列，通过对他的进一步生物信息学分析，发现其有已知的△15位脱饱和酶所具有的两个组氨酸保守区域，是一个推测的△15去饱和酶基因部分序列。通过分子克隆和RACE技术得大小为1308bp基因序列，称为Ptω3。对Ptω3序列编码的从序列进行生物信息学分析，发现该基因编码一个435个氨基酸的酶，该酶是一个膜蛋白，有5个疏水性区域及相应的5个跨膜螺旋区域，可能定位于叶绿体膜内。用高保真酶系统以cDNA为模板进行PCR扩增，将Ptω3克隆进pYES2载体，转入酵母S.cerevisiae。用气相色谱分析培养的酵母细胞的总脂肪酸，当加入了外源亚油酸时，在转基因酵母中产生了代表α亚麻酸的新峰，从而确定该基因编码了一个△15位脂肪酸去饱和酶。该成果为揭示三角褐指藻EPA生物合成提供了基础，为海洋微藻生物合成EPA途径的遗传改良及基因工程应用奠定了理论基础，也为构建转基因植物提供了良好的基因资源。