荔枝果皮花色素苷生物合成相关结构基因的克隆和表达特性研究(摘要)

摘要

本课题组针对荔枝色泽表现多样性作了初步调查，展开相关的种质收集，发现不同荔枝品种/株系的色度角(h值)有很大差异，有些晶种成熟时h值小呈深红色或紫红色如‘桂糯’(俗称‘紫皮荔’)；有些品种色度角在40°左右，呈鲜红色的如‘9911’、‘桂味’、‘糯米糍’等；有些品种如‘永兴2号’，色度角接近90°呈黄色；而有些品种色度角超过90°呈绿色，如‘鸭姆笼’、‘新球蜜荔’和‘魁星青皮甜’：‘妃子笑’和‘三月红’则表现为果面着色不均匀，果肩红色而果顶绿色。荔枝果皮的色泽与果皮中花色素苷的含量和分布密切相关，颜色深的果皮中花色素苷含量高而果实成熟时呈青色的品种基本检测不剑花色素苷。这些色泽表现不同的种质中的果皮色素组成差异还有待进一步研究。这些种质也为我们研究果实的色泽发育，探讨花色素苷生物合成的途径和调控，提供了极佳的素材。rn 本研究首先以成熟“糯米糍”荔枝果皮为材料，利用同源序列法，采用RT-PCR、RACE和巢式PCR等技术，克隆了花色素苷生物合成中7个结构基因的cDNA片段或全长，分别命名为Lc-pal,Lc-chs,Lc-chi，Lc-f3h，Lc-ans，Lc-ufgt，其中，克隆出的Lc-PAL cDNA全长2444bp,编码723个AA，5'-UTR 120bp，3'-UTR 152bp；克隆出的Lc-CHS cDNA全长1245bp,编码393个AA，5'-UTR 20bp，3'-UTR 42bp；克隆出的Lc-F3H cDNA全长1382bp,编码363个AA，5'-UTR 96bp，3'-UTR 194bp。然后用改良的Bugos法提取9911、三月红、妃子笑(成熟时绿色、黄色和红色部位)、糯米糍(绿果、黄果和红果时期)、白蜡(黄果和红果时期)、鸭姆笼、乌皮荔等12个果皮样晶的总RNA，根据已经得到的7个结构基因cDNA序列，分别设计7对特异引物，并设计一对内标引物actin，用半定量RT-PCR法，研究了7个基因在不同品种(株系)、同一品种不同发育阶段和成熟时着色不均匀品种的不同部位的表达情况，结果表明(图3)：PAL、CHS、CHI、DFR在不同样品中的表达比较一致，绿果与红果均有同等程度的表达；F3H及ANS在鸭姆笼样品果皮中的表达量明显少于其它样品；UFGT基因的差异表达最为明显，妃子笑成熟果绿色部位果皮UFGT基因的表达量很少，与糯米糍生长期果实和鸭姆笼相似，而该基因在妃子笑、糯米糍及白蜡黄果皮中的表达量次之，红色果皮中UFGT基因均有较高的表达量，且妃子笑红色果皮表达量最高，桂糯与白蜡比较接近。从半定量RT-PCR各基因的表达结果来看，UFGT基因可能是荔枝果皮花色素苷合成的关键基因，一定程度上决定着荔枝果实红色的显现；F3H及ANS基因不表达，极有可能是鸭姆笼品种成熟时果皮呈现绿色的原因。7个结构基因实时定量PCR的分析结果和半定量RT-PCR的结果基本一致(图4，以UFGT为例)。本研究为深入揭示荔枝果实花色素苷生物合成的分子机理，丰富果实色泽及其调控的知识，为生产上进行果实色泽的调控提供了理论依据，也为通过基因工程的手段改良果皮色泽打下了初步的基础。